Коротко и ясно.
М. В. Телков,
кандидат биологических наук
«Химия и жизнь» №8, 2006
Quote:
История открытия ПЦР-амплификации ДНК – блестящий пример эпохального изобретения, сделанного гениальным одиночкой; причем идея осенила изобретателя мгновенно и, как кажется, абсолютно непредсказуемо. Более того, свое авторство ему пришлось отстаивать (и удалось отстоять!) в нелегких сражениях.
Если вкратце – дело было так. Весной 1983 года, в пятницу вечером, Кари Маллис, 39-летний химик-синтетик из мало кому тогда известной калифорнийской биотехнологической фирмы Cetus, направлялся после работы домой. По пути он размышлял о том, как повысить точность идентификации точечных мутаций в геномной ДНК с помощью недавно предложенного метода олигомерной рестрикции. Суть метода состояла в энзиматическом удлинении олигонуклеотида, наплавленного на участок ДНК, прилегающий к участку мутации. Если дезоксинуклеотиды («кирпичики», из которых построена ДНК) добавлять в реакцию не все сразу, а по одному, то удлинение олигонуклеотида будет происходить только тогда, когда добавляемый дезоксинуклеотид комплементарен участку мутации. Анализируя результаты реакции, можно было выявлять наличие конкретной мутации в данном гене. (Замены одного нуклеотида на другой в молекулах ДНК происходят часто и иногда приводят к тяжелым последствиям, поскольку они могут нарушать структуру гена или регуляцию его активности. Такие мутации для многих важных генов картируют – устанавливают их точное расположение, – а затем изучают их генетические и биохимические последствия.)
Метод неплохо работал на относительно короткой ДНК, когда исследуемый ген был уже выделен, то есть когда его доля в общей массе ДНК была сравнительно высокой. Однако при исследовании огромной по длине геномной ДНК чувствительность метода была явно недостаточной, ибо концентрация данного гена оставалась крайне низкой.
Маллис размышлял о том, как повысить чувствительность и специфичность этой реакции. Как он сам писал впоследствии, для того чтобы решить проблему, ему нужно было увеличить количество ДНК исследуемого гена. В мысленном эксперименте он увидел, что точность метода можно повысить, если в дополнительной пробирке провести аналогичную дополняющую реакцию, то есть наращивать олигонуклеотид с другой стороны мутации, используя еще один праймер, располагающийся на комплементарной цепи ДНК. Если данные двух этих экспериментов будут согласовываться, то, по крайней мере, вдвое надежней можно будет судить о наличии или отсутствии мутации в исследуемом участке гена.
Он крутил эту идею и так, и этак, и вдруг его осенила светлая мысль: если реакцию с двумя такими праймерами-олигонуклеотидами проводить не в двух, а в одной пробирке, то количество фрагмента ДНК, ограниченного олигонуклеотидами, увеличится вдвое. Если реакцию повторить – вчетверо! Если ее провести 20 раз (это несложно, поскольку один ее цикл занимает несколько минут) – количество окруженного олигонуклеотидами фрагмента возрастет в миллион раз. А если повторить реакцию 30 раз – в миллиард раз. Эврика! Это означало, что теперь фрагменты геномной ДНК, в том числе и гены, можно будет выделять не за годы упорного и кропотливого труда, а всего за один день!
«Это изменило бы молекулярную биологию», – подумал тогда Маллис. Идея показалась ему настолько красивой, что он остановил машину, зашел в придорожный киоск, купил ручку, бумагу и стал подсчитывать, сколько же в придуманной им реакции получается ДНК. Все сходилось – метод должен работать и продуцировать огромные количества специфической ДНК. Одновременно Маллису стало мниться маловероятным, чтобы эта идея, теперь казавшаяся очевидной, уже не приходила в чью-либо голову. Чтобы найти ошибку в своем рассуждении, во время уик-энда Малис «исписал формулами все горизонтальные поверхности в своем загородном доме». И, как поведал позднее в Нобелевской лекции, все выходные промучился жесточайшими перепадами настроения от абсолютного восхищения мощью собственного интеллекта и своей удачливостью – и до полнейшего отчаяния при мысли о том, что где-то в рассуждениях он не видит очевидной ошибки. А она должна была присутствовать, ибо идея очевидна, ведь все этапы реакции по отдельности уже были опробованы тысячами молекулярных биологов и постепенно становились лабораторной рутиной. Кто-то наверняка уже реализовал бы эту идею! Но ни о чем подобном ему слышать не приходилось...
В понедельник рано утром Маллис помчался на работу (что, как он сам отмечал, случалось с ним крайне редко), чтобы в библиотеке выяснить, не опубликовал ли кто-нибудь статьи на эту тему. Каковы же были его удивление и восторг, когда он понял, что ничего подобного в научной литературе еще описано не было!
И через несколько месяцев, а именно 16 декабря 1983 года, перепробовав со своим сотрудником и учеником Фредом Фалуной множество экспериментальных подходов, Кари Маллис осуществил первую успешную реакцию ПЦР – полимеразную цепную реакцию амплификации ДНК (по-английски – PCR, Polymerase Chain Reaction). И она действительно произвела революцию в современной молекулярной биологии. А вскоре нашла применение в областях, весьма далеких от академической науки.
Во время каждого цикла (продолжительностью 1–3 мин) количество фрагмента ДНК, ограниченного с обоих концов положением олигонуклеотидных праймеров, удваивается. А после 25–30 температурных циклов этого специфического фрагмента ДНК оказывается в миллионы раз больше, чем в начале реакции. К тому же он получается практически абсолютно чистым.
Этого количества ДНК уже достаточно для дальнейшего анализа амплифицированного фрагмента, например, с помощью электрофореза, или даже для определения его структуры путем секвенирования.
Реакция ПЦР-амплификации во многие тысячи раз упростила, ускорила и удешевила процесс выделения специфического фрагмента ДНК, например, какого-то гена. Если для клонирования участка ДНК классическими генно-инженерными методами требовалось в среднем 0,5–2 года и огромное количество крайне трудоемких генно-инженерных действий высококвалифицированного персонала, то с помощью ПЦР-амплификации фрагмент (правда, лишь если известны его концевые последовательности) можно выделить всего за один рабочий день! В этом и состоит основная ценность метода. За прошедшие годы появилось огромное количество разных модификаций метода и его применений.
Сейчас реакция ПЦР-амплификации – рутинный и ежедневный инструмент в каждой молекулярно-биологической лаборатории. Применяя специфические олигонуклеотидные праймеры (все дело именно в этом), варианты метода теперь используют не только в молекулярной биологии и биотехнологии, но и в медицине (например, для идентификации микроба или вируса по его ДНК, для контроля излечения пациента от инфекционного заболевания, идентификации типа мутации в геномной ДНК при анализе наследственных заболеваний). Находит применение эта реакция и в криминалистике для идентификации личности по ДНК-содержащим жидкостям и тканям (модификацию исходного метода криминалисты назвали в стиле своей профессии – «геномная дактилоскопия»). Используется она и для установления отцовства, степени родства, популяционных исследований – словом, везде, где нужно установить для той или иной цели уникальную последовательность ДНК, опираясь на минимальное количество исходного ДНК-содержащего материала: капельку крови, мочи, соскоб с ткани, отдельный волос.
А поскольку ДНК сравнительно хорошо сохраняется, этот метод позволяет исследовать даже древние останки. Были проведены научные работы по анализу ДНК неандертальца и египетских мумий, по исследованию ДНК насекомых, законсервированных в янтаре миллионы лет назад, или бактерий из глубокозалегающего древнего арктического льда (что позволяет заглянуть в историю эволюции) – но это уже другая интереснейшая тема. В середине 1990-х с помощью метода ПЦР-амплификации ДНК исследовали останки царской семьи Романовых.
Однако огромные возможности метода ПЦР-амплификации ДНК не всем сразу стали очевидными, и многие из тех, кому Кари Маллис изложил свою идею, отнеслись к ней с прохладцей. Так было и на семинаре фирмы Cetus в августе 1984 года, когда он впервые доложил свою идею, так было и когда он все лето этого года излагал ее многим молекулярным биологам и в фирме Cetus, и вне ее стен... Его коллеги вяло соглашались: дескать, да, должно получиться. И все! Дело в том, что все исходные компоненты предложенной Маллисом реакции были давно описаны и исследованы по отдельности, а вот использовать их совместно, для амплификации ДНК не додумался никто!
Как впоследствии сказал Маллис в своей Нобелевской лекции, единственный человек, который с энтузиазмом поддержал его идею с самого начала, был его друг – основатель фирмы Biosearch, выпускающей аппараты для автоматического синтеза олигонуклеотидов (одного из компонентов реакции ПЦР-амплификации): «Он знал, что это будет хорошо для его фирмы!»
Кстати, термостабильную ДНК-полимеразу, необходимую для этой реакции, впервые выделили и исследовали за несколько лет до этого советские ученые А.С. Каледин, А.Г. Слюсаренко и С.И. Городецкий из института ВНИИгенетика. Их статья вышла в апреле 1980 года в журнале «Биохимия». С.И. Городецкий и его сотрудники в то время занимались изучением так называемых термофильных бактерий, обитающих в воде гейзеров и горячих источников. Для выяснения причин необыкновенной устойчивости бактерий к высокой температуре они выделяли их ферменты. При этом и была найдена та самая термостабильная ДНК-полимераза, которая с подачи Кари Маллиса нашла применение в реакции ПЦР-амплификации.
В своих статьях Маллис ссылается на работу советских авторов по выделению термостабильной ДНК-полимеразы. Одно время в научной беллетристике даже обсуждали вопрос о том, не должны ли фирмы, продающие этот фермент и получающие миллиардные прибыли, платить определенный процент тем биохимикам, кто опубликовал методику его выделения и впервые исследовал. Но фирмы сослались на то, что молекулярный вес их термостабильной полимеразы несколько отличается от описанной советскими учеными и, стало быть, фирмы якобы выделяют не тот же самый фермент, хотя и по той же методике и из того же вида бактерий!
Это, конечно, грубая натяжка, ведь ошибка в измерении молекулярного веса составляет обычно не менее 15–20 %. В этот интервал точности укладывается большое количество разных белков, в том числе, очевидно, и термостабильные полимеразы. Поэтому абсолютно точно установить молекулярный вес фермента А.С. Каледин, А.Г. Слюсаренко и С.И. Городецкий просто не могли, да они и не ставили перед собой такой задачи! А стало быть, и отрицать их авторство на основании неточности в измерении молекулярного веса термостабильной полимеразы неверно с научной точки зрения. Однако спорить с колоссальными фирмами в судах стоит огромных денег, которых, очевидно, нет, – так что богатые продолжают богатеть, а бедные – как вы и сами догадываетесь...
Судьба статьи, в которой Маллис впервые описал метод ПЦР-амплификации, тоже не была простой. Как рассказал сам ученый, первую ее версию редакция международного научного журнала Science, одного из самых престижных в мире, отклонила. Отписка была стандартной: журнал публикует-де только статьи, которые имеют общенаучное значение, а метод ПЦР-амплификации технический и представляет интерес только для специалистов. Редакторы рекомендовали Маллису обратиться в более специализированный научный журнал. Щадя самолюбие авторов, так часто отвечают редакции журналов, если не принимают научную статью по тем или иным причинам. Под тем же предлогом отклонил статью и Nature.
Кари Маллису, который занимался тогда полупромышленным синтезом олигонуклеотидных праймеров в фирме Cetus, пришлось кооперироваться с соседней лабораторией и на их тематике и объектах продемонстрировать возможности предложенного им метода. Сделать это пришлось ценой уступки мест первого и последнего авторов в статье. (Первой обычно стоит фамилия того, кто внес наибольший экспериментальный вклад в статью, а последней – главного идеолога и руководителя проекта. Так что отстоять свой приоритет в изобретении метода Малису было уже непросто...) Однако в новом виде статья стала уже вполне полновесной – в ней метод ПЦР-амплификации был продемонстрирован на понятном и имеющем несомненную практическую важность примере – пренатальной диагностике наследственного заболевания. Статья была опубликована в журнале Science 20 декабря 1985 года (№230). В 1986 году аналогичная статья с участием Маллиса вышла в Nature (в №6093).
И после этих публикаций начался бум: международное научное сообщество сразу оценило важность открытия. Метод нашел огромное количество приложений, в научной литературе пошел вал публикаций о его применении. Вскоре пришло и признание: в 1990 году Маллис был награжден престижной Preis Biochemishe Analytik – национальной немецкой премией в области аналитической биохимии, в 1992 году признан ученым года штата Калифорния, в 1992 году награжден премией имени Роберта Коха, в 1993 году – Национальной премией Японии, и в том же году ему вручили Нобелевскую премию по химии.
Эта характерная часть несет в себе уникальный код из цепочки нуклеотидов и поэтому с помощью органической химии с участием того самого метода ПЦР, устанавливается присутствуют заданные цепочки в исследуемом образце или нет.
Точно так же, можно звонить в любое новое МММ, и спрашивать - не обманывают ли они вас. Вы что, действительно настолько наивны?...
